Що таке ІФА аналіз крові і чому це важливо для діагностики

Що таке аналіз крові, що проводиться методом ІФА

Це лабораторне дослідження, яке дозволяє визначати наявність специфічних антитіл (захисних факторів крові білкової природи) до певних антигенів (хвороботворним агентам). Серед антитіл першорядне значення мають імуноглобуліни, які можуть існувати у вигляді іммунокомплексов.

Імуноглобуліни виробляються внаслідок складних нейрогуморальних реакцій імунітету людини, що виникають як реакція у відповідь на впровадження чужорідних антигенів. На кожен вид хвороботворного агента виробляються свої специфічні антитіла. Діють вони шляхом «зв’язування» антигену або патологічного мікроорганізму, утворюють комплексну сполуку «антиген-антитіло» з подальшою нейтралізацією, ферментативним лизисом, реакціями фагоцитозу і виведенням з організму.

Зверніть увагу: саме за наявністю певних комплексів методом ІФА визначається вид збудника або наявного у хворого шкідливої ​​речовини.

Дізнатися базові принципи функціонування імунітет людини ви зможете, подивившись цей відео огляд:

Іммуноаналіз сендвіч-типу Sandwich-type immunoassay

Мал. 2. Схематичне зображення імуноаналізу «сендвіч»-типу. АТП – антитіло підкладки, АТД – детекторне антитіло, АГ – антиген, М – мітка, ковалентно пов’язана з детекторним антитілом, П – підкладка, на яку сорбируется антитіло підкладки.

В даному варіанті імуноаналізу (Рис.2) використовується пара антитіл, специфічних до просторово віддаленим епітопів досліджуваного антигену.

I. Сорбція антитіл підкладки

В лунки 96-ямкового планшета для проведення імуноаналізу сорбують антитіла підкладки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-сольового буфера (PBS). Інкубація проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. Відмивання (2-х кратна) незв’язаних молекул антигену здійснюється фосфатно-сольовим буфером містить 0,1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокування

Для блокування місць неспецифічного зв’язування лунки планшета заповнюють PBST і інкубують протягом 10-15 хвилин при кімнатній температурі.

III. Інкубація з антигеном

В лунки планшета з преадсорбірованимі антитілами вносять по 50 мкл досліджуваного розчину або стандартних розведень антигену. Розведення антигену повинні бути приготовлені на основі PBST, оскільки Tween-20 знижує неспецифічне зв’язування білкових молекул один з одним і з поверхнею планшета. І досліджуваний розчин, і стандартні розведення антигену вносять попарно (або по 3 повторності), використовуючи по дві (три) лунки на кожне розведення білка. Інкубацію проводять при кімнатній температурі протягом 30 хв при постійному перемішуванні. Відмивання здійснюється розчином PBST 3 рази.

IV. Інкубація з антитілами, кон’югованими з ферментної міткою

В лунки планшета вносять по 100 мкл розчину специфічних антитіл, кон’югованих з ферментної міткою. Оптимальна концентрація кон’югованих антитіл як правило вказується виробником (зазвичай використовують концентрацію 2-4 мкг / мл). Інкубація з антитілами, що містять ферментну мітку, проводиться протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і струшуванні на горизонтальному шейкері для планшетів. Відмивання здійснюється за допомогою PBSТ 5-6 разів.

V. Проведення ферментативної реакції, що супроводжується появою пофарбованого продукту

В лунки вносять по 100 мкл розчину субстрату і інкубують протягом 10 хв при кімнатній температурі і постійному перемішуванні.

VI. Зупинка ферментативної реакції

Перед вимірюванням оптичної щільності проводять зупинку кольорової реакції з допомогою 0,5 М H2SO4. В лунки з робочим розчином ОФД після інкубації вносять по 50 мкл розчину 0,5 М сірчаної кислоти. Після цього можна відразу приступати до вимірювання оптичної щільності.

VII. Вимірювання оптичної щільності

Оптична щільність розчину пофарбованого продукту вимірюється при λ = 490 нм з використанням планшетного спектрофотометра.

Версія для друку

Які бувають імуноглобуліни

Відкрито і вивчено 5 основних класів імуноглобулінів – IgА, IgM, IgG, IgD, IgE. роль інших ще до кінця не з’ясована і вона знаходяться в стадії наукового дослідження.

Зверніть увагу: найбільш важливе в практичній медицині значення мають імуноглобуліни класів – А, М і G. Інформативність визначення заснована на різних часових проміжках їх появи, максимуму і зникнення.

Розглянемо це питання більш детально.

Основне завдання імуноглобуліну А (IgA) полягає в захисних функціях слизових оболонок дихальних шляхів, шлунково-кишкового тракту та сечовидільної системи. При гострому початку захворювання виявити їх неможливо. З’являються ці захисні комплекси лише з 2 тижні початку захворювання, іноді пізніше. Основна маса імуноглобуліну А зосереджена в слизових тканинах. Орієнтовно близько 80%. Решта антитіла циркулюють в крові. Основна функція – знешкодження і знищення мікроорганізмів. Після стихання гострих проявів захворювання кількість цих імуноглобулінів починає зменшуватися і повністю йде на терміні до 8 тижнів після початку хвороби. Якщо IgA виявляються в більш пізні терміни, то це свідчить про хронізації процесу.

Головними і першими маркерами гострої фази розвивається патології є імуноглобуліни класу М (IgM) . Виявляються вони до 5 діб початку нездужання. Визначити їх наявність в крові можна близько 6 тижнів. Потім вони починають швидко зникати.

Остаточний імунну відповідь характеризує наявність в крові імуноглобулінів класу G (IgG) . Поява цих факторів в крові виявляється приблизно через місяць після початку хвороби. Надалі вони можуть визначатися протягом багатьох місяців, років і навіть все життя, виконуючи захисну функцію від повернення (рецидиву) хвороби, а в деяких випадках унеможливлюючи вторинне розвиток патології. Якщо ж кількість імуноглобуліну G початок знову рости, то можна підозрювати повторному зараженню. Подібний висновок можна зробити шляхом проведення двох-трьох проб, зроблених з проміжком в 2 тижні.

Імуноглобулін Е (IgE) використовується в практиці паразитології.

Імуноглобулін D (IgD) розташовується на B-лімфоцитах, знаходиться в невеликій концентрації у здорових людей. Після 10 року життя досягає максимальних значень. Кількість імуноглобуліну D збільшується при вагітності, у хворих на системні захворювання сполучної тканини, на бронхіальну астму, захворюваннями, викликані імунодефіцитний стан.

Протипоказання

Кардинальних протипоказань для проведення імуноферментного дослідження не виявлено. Іноді при вагітності, коли у пацієнтки спостерігається безперервна зміна гормонів в крові, може знадобитися неодноразове проведення аналізу для більш достовірного результату. Діагностичний метод не рекомендується використовувати після:

• хірургічних втручань;
• гемолізу (руйнування еритроцитів);
• переливання крові;
• взяття пункції або біопсії біологічного матеріалу.

Показання до призначення імуноферментного аналізу крові

Визначення антитіл до наявності в організмі хвороботворних мікробів, що викликають:

• сифіліс;
• трихомоноз;
• уреаплазмоз і мікоплазмоз.

Є зростання кількості імуноглобулінів і при глистовихінвазіях.

Діагностика проводиться для виявлення:

• герпетичних захворювань;
• групи вірусних гепатитів;
• вірусу Епштейна-Барра;
• цітомегоаловіруса.

За допомогою ІФА можна визначати наявність антитіл до 600 видів алергенів, виявляти стан імунодефіциту, проводити комплексне обстеження перед Трансплантологічний операціями, проводити комплексний аналіз на предмет ефективності лікування.

ІФА є додатковим методом виявлення онкологічних клітин.

підготовка

Принцип даного виду дослідження крові базується на освіті в організмі людини специфічних антитіл при попаданні в нього антигенів, тобто чужорідних агентів, що викликають розвиток того чи іншого захворювання. В результаті їх взаємодії утворюються комплекси «антиген – антитіло», які і піддаються дослідженню при здійсненні імуноферментного аналізу.

У зв’язку з цим, щоб не вплинути на дані комплекси і, відповідно, на достовірність отриманих результатів, аналіз крові та іншого біологічного матеріалу на ІФА вимагає певної підготовки.

Кров здають натщесерце, також за 14 днів до передбачуваного обстеження специфічне лікування припиняється і вживання антибактеріальних, противірусних лікарських препаратів припиняється.

Кров на ІФА здається з вени. Безпосередньо перед забором крові слід обмежити фізичні навантаження, а також виключити куріння і вживання алкогольних напоїв.

Як проводиться ІФА крові

Для імуноферментного аналізу в більшості випадків використовується кров пацієнтів, іноді роблять забір тканини склоподібного тіла, рідини спинномозкового каналу, навколоплідних вод.

Кров набирають через ін’єкційну голку в шприц з ліктьової вени. Дослідження проводять натщесерце. Слід пам’ятати, що прийом деяких медичних препаратів може впливати на результат аналізу. Перед здачею крові необхідно утриматися від куріння, вживання алкоголю. Спотворити результати може прийом наркотичних речовин.

У разі негативних значень імуноглобулінів IgM, IgG, IgA можна говорити про відсутність захворювання або його початковій фазі, також результат з мінусами можливий при повному одужанні після значної кількості часу.

Якщо IgA і IgM не виявлені, а IgG проявляється позитивно, то цілком ймовірно мова йде про сформований імунітет після інфекційного захворювання, або після щеплення.

У разі високого титру IgM при негативних значеннях IgG, IgA можна робити висновок про наявність гостро протікає інфекційного захворювання.

Одночасні позитивні значення результатів імуноглобулінів – IgA, IgM, IgG характерні для гострої фази рецидиву наявного хронічного захворювання.

Для хронічної інфекції, що знаходиться в фазі стихання процесу (ремісії) ІФА показує негативні значення імуноглобуліну M (IgM), при цьому результат імуноглобулінів G (IgG) і A (IgA) буде позитивним.

набори реагентів

Набори для імуноферментного аналізу випускають різні виробники, в самих різних комплектаціях. У України визнаною є. Даний виробник випускає набори реагентів для дослідження методом ІФА практично всіх поширених в наших широтах інфекцій, піддаються аналізу таким способом. Крім безпосередньо самих реагентів в комплекти входять додаткові матеріали, що забезпечує безпеку, зручність і швидкість виконання аналізу. Крім того, хімічні субстанції пофарбовані в різні кольори, що знижує ймовірність помилки у виборі реагенту лаборантом.

Відрізняються хіміко-біологічні набори відносною доступністю, що прямо впливає на поширення і доступність імуноферментного аналізу для населення.

Переваги методу імуноферментного аналізу крові

Головними перевагами методу ІФА є:

• невисока собівартість аналізу;
• діагностична специфічність, точність;
• динамічний контроль (повтор аналізу для визначення ефективності лікування і стадій захворювання);
• можливість проведення масових обстежень в осередках інфекції;
• швидкість отримання результату;
• відносна простота аналізу;
• можливість використання інформаційних технологій в обробці;
• безпеку і безболісність для пацієнта.

коли призначають

Метод ІФА вважається одним з найбільш точних методів діагностики, його достовірність – більше 90%. Аналіз застосовують для виявлення різних серйозних захворювань і небезпечних станів.

Які патології можна виявити:

• вірусні гепатити;
• ВІЛ;
• цитомегаловірусна інфекція;
• герпетичні патології;
• мононуклеоз;
• токсоплазмоз;
• краснуха, кір;
• деякі види паразитозов;
• патології, викликані хелікобактер пілорі;
• онкологічні захворювання;
• алергічні реакції;
• гормональні порушення;
• проблеми в роботі репродуктивної системи;
• аутоімунні патології;
• порушення розвитку, каліцтва плоду.

Імуноферментний аналіз крові при вагітності дозволяє оцінити ризик розвитку деяких патологій нирок, серця, судин.

Діагностику проводять для контролю рівня антитіл, які можуть викликати у дитини серйозні неврологічні розлади.

Імуноферментний аналіз крові в паразитології

Можливість застосування ІФА в діагностиці паразитарних захворювань визначається специфічним імуноглобуліном E (IgE), який має тенденцію до підвищення саме при цій групі захворювань. Крім того, імуноглобулін Е є маркером атопічних реакцій пов’язаних з алергічними процесами. У крові він знаходиться в незначних кількостях. Основна його локалізація – слизові оболонки, базофіли, маркофагі. Головна функція цього білкового комплексу полягає в захисті слизових оболонок організму. Але в той же час він є учасником імунних реакцій, спрямованих проти паразитів. Активацією IgE «завідують» еозинофіли і макрофаги. Це важливий факт в зіставленні даних аналізу при встановленні діагнозу хвороби.

ІФА застосовується для виявлення:

• круглих гельмінтів (аскарид, гостриків);
• гострої і хронічної форми описторхоза;
• трихінельозу;
• наявності лямблій (як додатковий аналіз);
• форм лейшманіозу;
• амебіазу;
• змісту токсоплазм;

Важливо: імуноглобуліни виробляються в організмі в якості антитіл до певних антигенів. Тому навіть при найвищій специфічності аналізу не виключаються похибки в точності. При паразитарних захворюваннях відсоток ймовірності становить близько 90%.

На закінчення необхідно відзначити, що сучасна імунологія постійно знаходиться в стадії розвитку, пошуку нових методів діагностики і лікування захворювань.

Степаненко Володимир, хірург

67, всього, сьогодні

( 54 голос., Середній: 4,17 з 5)

Схожі записи

• Аналіз крові на ліпіди

• Аналіз крові на креатинін: норми, розшифровка, як здавати

Трохи про захисну роль білків в організмі людини

Після інфікування людські антитіла змінюють свою концентрацію в крові, в залежності від етапу захворювання. Саме дослідження кількості і якості антитіл допомагають визначити, гостра ця фаза або хронічна і наскільки ефективно організм справляється з чужорідної флорою.

Аналіз ІФА ефективний при дослідженні на гормональні порушення, визначення онко- та імунних розладів. Може на ранніх стадіях виявити такі серйозні захворювання, як гепатит В і сифіліс, ВІЛ-інфекцію, а також ряд вірусів, які не виявляють себе, наприклад, цитомегаловірус.

Плюси і мінуси

Імуноферментний тип діагностики має ряд переваг перед іншими методами обстеження:

1. Висока чутливість (досягає 90%)
2. Прийнятна ціна наборів для діагностики.
3. Стабільність при зберіганні всіх інгредієнтів для проведення тесту (більше року);
4. Можливість виявлення інфекції на першій стадії.
5. Зручність і оперативність проведення дослідження.
6. Придатність для масових обстежень.
7. Уніфікованість.
8. Можливість застосування мінімальної кількості діагностується матеріалу.
9. Легкість у відстеженні динаміки протікання патології інфекційного характеру.
10. Доступність (сьогодні імуноферментний аналіз проводиться у всіх лікарнях і поліклініках)
11. Автоматизація етапів реакції.

З недоліків дослідження варто назвати:

• Виявляє не найбільш збудника хвороби, а імунна відповідь організму на проникнення в нього патогена.
• Можливість отримання ложноположительного (помилково негативні) результату через прийом деяких медикаментів, технічних недоліків, порушеного обміну речовин, наявності декількох хронічних захворювань.

можливості методики

Область застосування аналізу крові на ІФА досить широка – на даний момент неможливо і уявити, наскільки б ускладнилися пошуки причини безлічі захворювань. Таке дослідження тепер застосовується практично у всіх медичних галузях, навіть в онкології. Хоч для необізнаних це складно зрозуміти, але в окремих випадках провівши його, вдалося врятувати життя пацієнтам, виявивши пухлину на ранніх стадіях.

Важливо! ІФА – аналіз крові, який показує маркери, характерні для деяких злоякісних процесів, що дозволяє виявити захворювання на тому часовому етапі, коли ніякому іншому способу це непідвладне.

В сучасних діагностичних центрах, лабораторні обстеження представлені не тільки онкомаркерів – вони забезпечені значним арсеналом панелей для проведення даної діагностики. З їх допомогою можна визначити безліч патологічних станів, таких як гормональні відхилення та інфекційні процеси різного походження.

Крім цього, проведення та розшифровка аналізу крові ІФА дасть можливість відстежити дію медичних препаратів на організм хворої людини і навіть тварини. Останнє широко застосовується в ветеринарних клініках, допомагаючи зберегти здоров’я нашим домашнім вихованцям або годувальників, що забезпечує стабільне надходження м’ясної, молочної продукції і незамінних в раціоні яєць.

Так, в результаті забору всього декількох мілілітрів венозної крові і її діагностики методикою ІФА, лікар, описавши матеріали дослідження, зможе визначити:

• гормональний стан, що включає біологічно активні речовини статевих і щитовидної залоз, а також надниркових залоз;
• наявність бактеріальної та вірусної інфекції (гепатит В і С, сифіліс, герпес, хламідіоз, туберкульоз, міко-та уреаплазмоз, ВІЛ, TORCH) та інші захворювання даної природи;
• ознаки життєдіяльності збудників патологічного процесу, що завершився одужанням і перейшов в стадію утворення антитіл (імунної відповіді).

Такі комплекси набагато простіше розпізнаються і ліквідуються клітинами імунітету. Залишкові явища у вигляді антитіл у множинних випадках містяться в крові довічно, що практично зводить ризики повторного зараження до нуля.

Імуноферментний аналіз крові на паразитів та інших мікроорганізмів – шкідників здоров’ю організму дає можливість не тільки встановити наявність збудників, а й розповість про їх чисельності в плазмі крові пацієнта. Таким чином, подібне дослідження дозволяє зробити і якісний і кількісний аналіз патогенних мікроорганізмів, виявлених в сироватковому матеріалі.

Рівень концентрації збудника в значній мірі впливає на розвиток інфекції та швидкість одужання, тому якісна оцінка вважається не менш важливою, ніж кількісна. Їй відводиться далеко не остання роль як при лікуванні дітей, так і дорослих. Але як же виходить, що ІФА вдається розпізнавати такий великий діапазон мікроорганізмів, які паразитують в тілі людини і тварин, приносячи шкоду і знижуючи якість життя?

Методика дослідження будується на кількох варіантах (прямий і непрямий – конкурентний і неконкурентний) виконання поставлених завдань, причому кожен з них призначений для певних цілей. Такий підхід дозволяє виробляти цілеспрямований пошук, і в найкоротші терміни виявляти причину тієї чи іншої патології.

При попаданні в лунку з плазмою крові, антигени або антитіла ідентифікують в зв’язку зі своєю спрямованістю об’єкт, і формують комплекс (АГ – АТ). Дане освіту закріплюється ферментним з’єднанням (кон’югатом), який згодом виявиться зміненим фарбуванням лунки. ІФА проводиться на специфічних тест-системах, виготовлених в профільних лабораторіях і укомплектованих повним набором реагентів.

Даний аналіз можна виконувати на вошер – промивних апаратах і зчитують спектрофометров, але вони вимагають ручної праці. Безумовно, лаборанту в кілька разів зручніше і швидше здійснювати всі маніпуляції на повністю автоматизованих приладах. При їх використанні співробітники лабораторії звільняються від великого обсягу монотонної діяльності – промивання, закапування і решті рутини, але не всі лікувальні установи можуть собі дозволити таку дорогу апаратуру

Тому багато лікарень і діагностичні заклади продовжують здійснювати ІФА по-старому – на напівавтоматах.

Інтерпретація матеріалів дослідження виключно компетенція фахівця лабораторної діагностики – тільки йому можуть розповісти результати про специфіку і тонкощі перебігу захворювання. При цьому лікар повинен обов’язково врахувати можливість отримання помилково негативні або хибнопозитивних відповідей.

В основі результатів ІФА аналізу лежить отримання хімічних реакцій на ферменти, службовці особливими розпізнавальними знаками для розпізнання антитіл. Отже, під час иммунохимических реакцій антитіла починають взаємодіяти з деякими антигенами. Все це дає підстави стверджувати, що помилкові результати при здачі крові на ІФА мінімальні.

Дослідження дозволяє визначити кількість імунних клітин, їх властивості, а також наявність необхідних антитіл

Позитивним результат вважається тоді, коли виявляється фарбування розчину. Забарвлення сигналізує про те, що антигени взаємодіють з антитілом. У разі коли нічого подібного не відбувається, результат є негативним.

Існує кілька методик і способи проведення імуноферментного аналізу: прямий і непрямий спосіб, конкурентний і метод блокування.

В основі проведення обстеження крові (будь-якого іншого біологічного матеріалу) на ІФА лежить алгоритм, що полягає в здійсненні двох реакцій – імунної і ферментативної.

В ході першої патологічні агенти зв’язуються з захисними елементами клітин біологічного матеріалу, взятого для дослідження. Утворюється імунний комплекс «антиген – антитіло». Виглядає це наступним чином. Антигени присутні на поверхні всіх клітин.

ПОДРОБИЦІ: Кров на хламідії розшифровка

При попаданні в організм чужорідних клітин відбувається їх захоплення імунними клітинами (на чиїх поверхнях розташовуються антитіла), які порівнюють дані про про антигени з поверхні новоприбулих клітин з інформацією, закладеної у власній «пам’яті». Що стосується розбіжності цих даних включаються захисні функції організму, які полягають в утворенні імунного комплексу.

Після цього здійснюють ферментативну реакцію, яка візуалізує результати попередньої реакції. Її принцип грунтується на перетворенні речовини з одного в інше. Для кожного виду ІФА утворює в процесі імунної реакції матеріалу існує певний фермент, обробку яким використовують для визначення концентрації чужорідного агента (за інтенсивністю забарвлення розчину).